英文標題：Monitoring and dynamically controlling glucose uptake rate and centralmetabolism
中文標題：監測并動態控制葡萄糖攝取速率和中樞代謝
發表期刊：nature chemical engineering
百趣提供服務：靶標代謝流
研究背景
近年來，系統代謝工程(Systems metabolic engineering)通過整合代謝工程、系統生物學、合成生物學及進化工程等多學科工具與策略，為構建高效生產藥物、化學品、飼料及食品添加劑的微生物細胞工廠開辟了新路徑。這一領域進展的核心在于對代謝過程中關鍵代謝物及合成途徑的精準監測與調控。然而，傳統方法在代謝物檢測的靈敏度、實時性以及對動態代謝通量的響應能力上存在顯著局限，難以滿足工業級生產的高效需求。
作為天然存在的信號探測器，能夠感知環境及細胞內外的代謝物濃度，其遺傳編碼版本（如基于熒光的基因回路）已成為代謝研究的重要工具。它們不僅可直接檢測目標分子或中間代謝物，還能通過動態調節基因表達，優化代謝通量分配，從而提升產物合成效率。但現有生物傳感器多局限于胞內中間代謝物的檢測，導致調控范圍受限，難以實現對整體代謝通量的全局控制。
葡萄糖(Glucose)作為微生物培養中最常用的廉價碳源，其攝取速率直接影響代謝通量分配、產物產量及生產效率。盡管傳統生物傳感器可監測葡萄糖濃度，卻無法直接捕捉攝取速率這一關鍵動態指標。為解決這一瓶頸，研究者開發了可編程雙功能遺傳回路GURB，實現了對葡萄糖攝取速率的實時監測，并基于此動態調控細胞代謝網絡，成功提升L-色氨酸(L-Trp)、核黃素(Riboflavin)及D-乳酸(D-lactic acid)等產品的微生物合成效率，為系統代謝工程的工業化落地提供了新思路。
研究結果
01-葡萄糖攝取速率生物傳感器的設計
DNA結合轉錄抑制因子Mlc是一種轉錄雙重調節因子，控制著大腸桿菌PTS和PEP系統中幾個編碼酶的基因的表達。基于Mlc在葡萄糖攝取中的功能，可將大腸桿菌的Mlc調控系統克隆至載體中，用以構建合成型葡萄糖攝取速率生物傳感器(Glucose uptake rate biosensors，GURB)，實現葡萄糖攝取速率的測量(圖1a)。具體而言，當葡萄糖存在時，葡萄糖攝取會伴隨EIIB(Enzyme IIB)的去磷酸化，生成葡萄糖-6-磷酸；接著，去磷酸化的EIIB可結合并招募Mlc至細胞膜；最后，Mlc與EIIB的結合促使熒光素酶的luc-C和luc-N結構域重新組裝并激活，添加熒光素底物后即可獲得可見光輸出(圖1b)。
基于上述機制，由“PptsG啟動子+GFPmut2熒光蛋白+p15AS載體”構建的初始生物傳感器GURB1被分別導入至六個具有不同葡萄糖攝取率的菌株中(MGU1-6)(圖1c)。結果顯示，攜帶GURB1的細胞的熒光強度與這六個菌株的葡萄糖攝取率呈負相關，表明GURB1反映出攝取速率的變化。此外，除了受Mlc抑制外，ptsG還受全局調控因子Crp的調控。
為探究Crp對PptsG的干擾效應，通過截短PptsG啟動子并在截短的PptsG中失活Mlc結合位點來激活熒光蛋白mCherry的表達，構建出3種傳感器變體(GURB2、GURB3和GURB4)，隨后也都同樣導入至MGU1-6菌株中。然而，僅有GURB3成功地破壞了Mlc結合位點而不影響啟動子活性(圖1d)。由此推斷，除了Mlc之外，還可能存在另一個激活ptsG表達的因素。值得注意的是，若再進一步截短啟動子，直至去除其中一個Crp結合位點時，所得傳感器GURB3-2在具有相同葡萄糖攝取率的菌株中的響應則有所減弱(圖1e)，這為后續更窄范圍內控制葡萄糖攝取率奠定了基礎。
圖1 葡萄糖攝取率生物傳感器的設計
02-正響應GURB的設計與優化
為構建葡萄糖攝取速率呈正響應的生物傳感器，通過Mlc結合位點及人工啟動子PAR的切割與組合，三種雜交啟動子被構建(圖2a)。結果顯示，Mlc結合位點在PAR啟動子中的位置顯著影響其表達強度(圖2b)，具體表現為：位于+1位點下游的PAD啟動子強度比原始PAR高約3.6倍；位于-10與-35區域間的PAM啟動子強度降低至PAR的約1.9倍。此外，Mlc還顯著抑制了PAD啟動子的轉錄(圖2b)，表明Mlc可通過結合DNA來阻礙轉錄。有趣的是，若進一步調整Mlc結合位點與+1位點的距離，則還會影響這些啟動子的動態范圍，呈現出顯著差異(圖2c)。由此可見，通過設計Mlc結合位點可以實現正響應GURB的構建。
后續，7種Mlc結合序列(來自ptsG、ptsH、malT、manX、mlc的啟動子)及表面等離子共振(SPR)技術被用于進一步優化提升生物傳感器動態范圍(圖2d)。其中，ptsHBS結合親和力最高(8.7×10-10)，manXBS1最低(3.73×10??)。另外，在體內測試中，結合親和力過強(如Mlc-ptsHBS)會導致回路對葡萄糖攝取速率響應降低，以及低攝取速率菌株的生長受損；親和力最弱的Mlc-manXBS1在低葡萄糖攝取條件下非但不影響菌株生長，反而動態范圍最佳(圖2e-f)。因此，蛋白質與DNA結合過強并非總有利于生物傳感器的設計。
圖2 對葡萄糖攝取率有正反應的GURB變異體的構建和鑒定
03-細胞內葡萄糖攝取速率的實時監測
GURB監測葡萄糖攝取速率的工作原理如圖3a所示：當葡萄糖攝取速率較低時，生物傳感器產生較少的熒光蛋白，便于監測；反之，當葡萄糖攝取速率較高時，則產生更強的熒光。為了驗證生物傳感器在細菌培養過程中的運行情況，將GURB28導入六種不同攝取速率的菌株進行培養。結果顯示，不同菌株間，在線熒光強度增強與離線葡萄糖消耗速率呈顯著正相關；同樣地，同一菌株的各培養階段，該正相關性也均持續存在(圖3c)。此外，該生物傳感器僅對葡萄糖高度敏感(圖3d)，且不受PTS系統中磷酸供體PEP的影響，亦證實了GURB的正交性。綜上，GURB可作為通量傳感系統的組成部分，反映出菌株的葡萄糖攝取速率。
圖3 GURB28反應的定量分析
04-通過GURB在不同培養條件下可視化葡萄糖攝取
通過選擇不同初始葡萄糖濃度、pH值、鹽濃度和溫度的培養體系，以探究菌株在不同培養條件下的葡萄糖攝取速率?？傮w而言，葡萄糖濃度與溫度對攝取速率影響相對較小：當初始葡萄糖濃度在1-20g/L范圍內時，菌株的攝取速率基本保持穩定，而低于3g/L時，葡萄糖被細胞快速完全消耗(圖4a)；當溫度在30-40℃變化時，攝取速率無顯著差異(圖4d)，但低攝取菌株的生長會在30℃下受到抑制。對于pH和鹽濃度而言，其葡萄糖攝取速率則表現出顯著變化：在pH7時，菌株攝取速率最高且生長良好，但隨著pH降低，其攝取速率嚴重下降，細胞生長顯著抑制(圖4b)，尤其在低攝取菌株MGU1中更為明顯；在鹽濃度0.5%時，攝取速率最高，但升至2.5%時，其攝取速率被嚴重阻斷，細胞生長顯著受抑(圖4c)，表明過高或過低的鹽濃度均會使葡萄糖攝取速率不同程度下降。以上結果證實，GURB能夠準確監測不同培養條件下菌株的葡萄糖同化情況。
此外，在連續培養實驗中，當環境條件(pH或鹽濃度)發生改變時，GURB傳感器的熒光信號也會迅速響應，反映攝取速率的動態變化。例如，pH從7降至4時，熒光強度顯著下降，隨著環境恢復，其信號也迅速回升；同樣地，鹽濃度從0.5%升至4%時，信號再次下降，恢復后信號再次恢復(圖4e)。若進一步與恒定pH和NaCl培養的對照組對比，可以發現，隨著培養條件的改變，細胞的最大葡萄糖攝取速率也相應波動(圖4f)。
圖4 利用在線生物傳感器與離線殘糖分析儀在不同培養條件下測定的菌株葡萄糖攝取速率
05-GURB對菌株內代謝途徑的動態調節
以L-Trp合成為概念驗證，用以測試GURB調控產物合成，L-Trp生產菌株T4首先被系統性構建。值得注意的是，磷酸戊糖途徑產生的關鍵前體E-4-P(赤蘚糖-4-磷酸)是L-Trp合成的主要限制性底物，盡管直接增強磷酸戊糖途徑基因的表達可提升L-Trp產量，但其增幅顯然不夠顯著(圖5b)。于是，通過進一步動態調控磷酸戊糖途徑通量(增強zwf基因表達、抑制ptsG基因表達)，一種依賴葡萄糖攝取速率的反饋回路被構建(圖5a)。顯而易見，在相同培養條件下，持有該反饋回路的T4DT菌株，其L-Trp產量較對于對照(T4菌株)提升了91%；同時，副產物乙酸的濃度顯著下降(圖5b)，表明其動態調控有效優化了碳通量分配，減少浪費。此外，與靜態調控菌株T4JT(基于T4菌株構建)、T4DTC菌株(敲除mlc的T4DT菌株)相比，動態調控菌株T4DT亦顯示出絕對優勢(圖5b)。隨后，經RT-qPCR證實，GURB對關鍵基因具有實時調控能力，即ptsG與zwf基因表達水平會隨著葡萄糖攝取速率的變化而被動態抑制或激活(圖5c)。
圖5 利用GURB系統通過動態調控強化大腸桿菌中L-色氨酸的生物合成
為了進一步驗證和應用GURB系統控制生物合成途徑，在核黃素生產菌株R1中引入類似的GURB反饋回路，以平衡生長與前體供應(圖6b)。結果顯示，動態調控(抑制pgi、激活zwf)的菌株R2DT的核黃素產量顯著高于靜態調控(敲除pgi并過表達zwf)的對照菌株R2JT(提高59.4%)，也遠高于敲除mlc的對照菌株R2DTC，凸顯出GURB反饋回路的動態調控在平衡生長與合成上的優勢。
類似地，針對需要強化糖酵解通量的D-乳酸生產，設計出相反的動態回路(激活pgi、抑制zwf)。如預期所料，動態調控菌株Lac04-DT的D-乳酸產量較原始菌株Lac04提高40.6%，并且也顯著優于靜態調控對照菌株Lac04-JT及敲除mlc的對照菌株Lac04-DTC(圖6d)。
綜上所述，在L-Trp、核黃素和D-乳酸三種不同產物的生物合成中，基于GURB的動態調控策略均能通過實時感知葡萄糖攝取速率，智能平衡中心代謝流，顯著提高目標產物產量并減少副產物，其效果優于傳統的靜態調控方法，驗證了該傳感-調控平臺的普適性與高效性。
圖6 利用GURB系統通過動態調控強化大腸桿菌中核黃素與D-乳酸的生物合成
研究總結
本研究成功開發了一套可編程的雙功能葡萄糖攝取速率生物傳感器(GURB)，實現了對細胞葡萄糖攝取速率的實時監測與動態調控。該工具成功應用于優化中心代謝，通過構建基于GURB的反饋回路，在L-色氨酸、核黃素和D-乳酸的合成中，動態平衡了不同代謝途徑的碳流，顯著提高了目標產物產量，并有效減少了副產物積累。這項工作突破了傳統靜態代謝工程的局限，為解決代謝失衡、提升微生物細胞工廠性能提供了強大的通用型合成生物學工具，在菌株篩選、智能發酵控制及復雜代謝網絡優化等方面具有廣闊的應用前景。
百趣生物靶標代謝流：基于穩定同位素示蹤技術，聚焦糖酵解、TCA循環、PPP途徑等關鍵代謝通路，可精準分析代謝物動態流量變化，實現代謝物高覆蓋、高精準定量，助力揭示代謝通路活性、驗證代謝調控機制，為生命科學研究及臨床轉化提供可靠數據支撐。
