英文標題：Self-assembled transdermal nanogels control scar formation by inhibiting fibroblast proliferation and fibrosis with glycolysis regulation via the PI3K/Akt/mTOR pathway
發表期刊：Journal of Nanobiotechnology
影響因子：12.6
客戶單位：上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
百趣提供服務：AQ能量代謝（中心碳代謝）
研究背景
肥厚性瘢痕(Hypertrophic Scars, HS)是整形外科領域最常見的挑戰之一。HS的形成與成纖維細胞的異常活化有關。這些成纖維細胞表現出過度增生和纖維化行為，可由糖酵解失調誘導。七甲川菁(Heptamethine Cyanine dyes, HCDs)是一種小分子近紅外染料，因其具有優先靶向性和光敏性，最早應用于腫瘤成像和治療。最近，有報道稱HCDs具有糖酵解抑制作用，并被推測優于傳統的糖酵解抑制劑。關于HCDs的作用機制，前期研究發現其可以通過調節糖酵解干預瘢痕形成。然而，HA-IR808(透明質酸HA修飾IR808形成的納米凝膠)作為HCDs的衍生物如何影響成纖維細胞糖酵解和疤痕形成仍不清楚。調節細胞糖酵解涉及多種介質，這些介質通過各種信號通路起作用。
研究概況
研究結果
01-HA-IR808的制備與表征
作者通過FT-IR光譜、透射電鏡等實驗對合成的HA-IR808進行檢測分析：FT-IR證實HA與IR808共價連接，透射電鏡顯示其為球形納米凝膠，C、O(來自HA)、Br(來自IR808)、S(來自4-氨基硫酚)元素信號均勻分布，表明HA-IR808通過HA介導的IR808與4-氨基硫酚偶聯合成。綜上，作者成功制備了自組裝的HA-IR808納米凝膠(圖1)。
圖1.HA-IR808的表征
02-HA-IR808的體內和體外遞送
作者通過共聚焦顯微鏡檢測HA-IR808的細胞內攝取，結果顯示HA-IR808在增生性瘢痕成纖維細胞(HS Fibroblasts, HFs)中吸收率較高(圖2a-d)。此外，HA-IR808優先靶向HFs而非正常皮膚成纖維細胞(Normal Fibroblasts, NFs)，基于共聚焦顯微鏡的HF/NF熒光強度分析顯示，與IR808相比，HA-IR808處理后的HF/NF熒光強度顯著提高，該結果經流式細胞術驗證。總之，HA-IR808的HF靶向特性更優，能更好地保護NFs免受不良副作用影響。
為揭示HA-IR808的細胞內攝取機制，作者針對HA受體CD44和IR808轉運體OATPs開展實驗(圖2e-i)。結果表明，CD44受體介導HA-IR808的細胞內攝取，且HA偶聯修飾未影響IR808的OATPs介導攝取途徑，即HA-IR808的攝取由CD44和OATPs協同介導。HFs和NFs上CD44與OATPs數量的差異，解釋了HA-IR808相較于IR808的優先攝取特性。
作者通過兔HS模型評估HA-IR808的透皮滲透與分布(圖2j-l)，結果顯示HA-IR808具有顯著透皮遞送能力，其介導的IR808熒光可穿透至真皮層，而游離IR808僅局限于表皮層；同時觀察到差異熒光分布，表明不同細胞類型間存在優先攝取。
圖2.HA-IR808的優先攝取
03-糖酵解抑制作用
為了確定IR808和HA-IR808如何抑制HFs中的糖酵解，作者通過qPCR、western blot等實驗，評估了關鍵糖酵解酶(HK2、PKM2、LDHA)和糖酵解轉運蛋白(GLUT1)的mRNA及蛋白表達水平(圖3a-d)。結果顯示，經IR808和HA-IR808處理后，上述糖酵解相關分子的mRNA表達顯著下調(圖3b)，蛋白表達也同步降低(圖3c-d)，且HA修飾未影響IR808的糖酵解抑制作用。
圖3.IR808和HA-IR808處理后的糖酵解水平
04-HA-IR808調控HFs糖酵解的機制
作者采用western blotting檢測PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達水平，以評估HA-IR808對PI3K/Akt/mTOR通路的影響(圖4a-b)。結果顯示，HA-IR808處理后，PI3K、Akt 和 mTOR 的磷酸化水平顯著降低，表明該信號通路受到抑制(圖4a-b)。為進一步驗證這一作用，作者使用PI3K/Akt激活劑IGF-1進行干預，結果顯示IGF-1可增加Akt和mTOR的磷酸化，而HA-IR808處理能顯著減弱該磷酸化效應(圖4c-d)。綜上，HA-IR808可作用于PI3K/Akt/mTOR信號通路。此外，IGF-1處理后，葡萄糖轉運蛋白(GLUT1)和關鍵糖酵解酶(HK2、PKM2、LDHA)的表達上調，而HA-IR808處理可有效拮抗這些作用(圖4e-g)。
圖4.HA-IR808處理下的PI3K/Akt/mTOR通路
05-HA-IR808對細胞增殖和纖維化的影響
為評估IR808和HA-IR808如何通過糖酵解通路影響瘢痕形成，作者聚焦增生性瘢痕成纖維細胞(HFs)的增殖能力和纖維化行為開展實驗。增殖能力檢測方面，通過CCK-8細胞活力檢測、EdU染色及細胞周期分析(圖5a-e)發現：CCK-8檢測結果顯示，HFs的細胞活力隨處理時間延長逐漸下降(呈時間依賴性)；EdU染色證實，增殖活躍的EdU陽性細胞數顯著減少；且HA-IR808與IR808均能誘導HFs停滯在細胞周期的G2/M期(這一機制與已知的糖酵解抑制劑2-DG一致)。綜上，二者對HFs增殖的抑制作用，很可能是通過抑制糖酵解介導的。
為驗證IR808和HA-IR808對細胞纖維化的影響，作者檢測了經典纖維生成相關因子(膠原I、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白)的mRNA和蛋白水平(圖5f-h)。結果顯示，IR808顯著降低這些纖維化蛋白的表達，HA-IR808的作用與IR808相似；此外，HA-IR808還能逆轉TGF-β誘導的過度纖維化。這種阻斷新生纖維形成的能力，強調了HA-IR808在早期階段阻斷瘢痕進展的治療潛力。
圖5.IR808和HA-IR808治療后的纖維化程度和增殖情況
06-HA-IR808介導糖酵解調控HFs增殖和纖維化的機制
為進一步闡明HA-IR808通過糖酵解抑制HFs增殖和纖維化的機制，作者對糖酵解、糖異生和TCA循環相關的代謝物進行檢測，以分析HA-IR808處理后的糖代謝重編程(圖6a-b)。具體結果表明：糖酵解中間體水平顯著降低，提示糖酵解通量下調，這與之前糖酵解酶在mRNA和蛋白水平的表達結果一致；HA-IR808處理后ATP產量顯著降低(圖6c)，而TCA循環中多種代謝物水平同步下降，說明正常能量代謝過程被破壞，這也進一步解釋了ATP的減少。
糖酵解過程中，甘氨酸的生物合成前體3-PG水平降低，表明支持膠原合成的甘氨酸代謝通量下調，進而影響膠原和核苷酸合成。此外，成纖維細胞的葡萄糖消耗和乳酸分泌檢測結果顯示，二者水平均降低，進一步證實糖酵解被下調。作者還分析了細胞中關鍵氨基酸(絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸)的濃度，發現HFs中這些氨基酸水平顯著高于正常成纖維細胞，而HA-IR808處理可有效下調該水平(圖6d、f)。
為進一步了解HA-IR808對甘氨酸/絲氨酸從頭合成及脯氨酸生成的調控機制，作者用IGF-1增強PI3K/Akt/mTOR信號通路活性。結果顯示，IGF-1刺激后上述氨基酸水平升高，而HA-IR808處理可逆轉該效應。綜上，HFs表現出高增殖和纖維化行為，其糖酵解及代謝中間體(甘氨酸/絲氨酸從頭合成、脯氨酸產生)表達上調；HA-IR808通過調節代謝、下調支持細胞增殖和膠原合成的關鍵中間體，最終抑制HFs增殖和纖維化。
圖6.HA-IR808處理的HFs中糖酵解途徑和氨基酸的代謝組學重編程
07-體內功效
在兔HS模型中評估HA-IR808的體內療效。結果顯示，對照組中膠原纖維在偏振光下呈現黃色(圖7b)；相比之下，HA-IR808處理組綠色膠原纖維所占比例較大，表明膠原I/III比例降低，即HA-IR808凝膠減輕了膠原沉積。此外，作者進一步研究發現，HA-IR808凝膠治療后，病變組織中GLUT1的表達受到抑制，而free-IR808組和對照組之間未觀察到顯著差異(圖7e-f)。
作者通過檢測PCNA(細胞增殖標志)和α-SMA(纖維化標志)的水平，比較各組間成纖維細胞的增殖活性和纖維化程度(圖7e-h)。通過免疫組化染色觀察這些指標的水平和分布，測定AOD值結果顯示，HA-IR808凝膠處理組PCNA和α-SMA表達均顯著降低，表明細胞增殖和纖維化水平均下降(圖7e-f)。Western blot分析(圖7g-h)和qPCR分析進一步證實了這些發現。這些結果表明，糖酵解的藥理抑制可有效抑制HS的纖維化行為和隨之而來的瘢痕形成。最后，研究人員評估了HA-IR808凝膠對PI3K/Akt/mTOR信號通路激活的影響(圖7i-k)，與對照組相比，給予HA-IR808凝膠導致病變部位p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比例降低，這與體外研究結果一致。總之，這些發現表明，HA-IR808可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調控糖酵解，進而抑制成纖維細胞增殖和纖維化行為。
圖7.HA-IR808治療的體內療效
研究總結
本研究提出了一種基于HA修飾的IR808靶向HFs的優先透皮給藥系統，研究了HA-IR808影響糖酵解的分子機制，并通過糖酵解進一步調控細胞增殖和纖維化。此外，本研究合成了HA-IR808，通過糖酵解控制成纖維細胞的纖維化和增殖行為，最終減少HS的形成。HA-IR808通過CD44和FAP靶向活化的成纖維細胞，實現透皮給藥。HA-IR808可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路下調成纖維細胞糖酵解，影響能量代謝和中間體合成，從而抑制細胞增殖和纖維化，達到干預瘢痕形成的目的。總體而言，本研究為HSs的早期臨床干預提供了一個合適的選擇。
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