產(chǎn)品介紹
普通代謝組學可以反映機體代謝物的變化及可能被激活的通路，同一代謝物可能參與多條代謝通路，但其總含量不發(fā)生變化。代謝網(wǎng)絡是復雜并且動態(tài)變化的，而普通代謝組學僅能提供靜態(tài)的代謝物豐度信息，因此仍存在局限性，代謝流分析（Metabolic Flux Analysis，MFA）技術則可以很好地彌補這一局限。穩(wěn)定同位素標記的代謝流分析技術更能體現(xiàn)細胞代謝網(wǎng)絡的動態(tài)變化，反映遺傳或環(huán)境因素擾動下的代謝重編程規(guī)律。通過在培養(yǎng)液中添加特定標記的底物，將13C或15N標記引入生物系統(tǒng)，隨著細胞的生長，底物被吸收并代謝生成不同的代謝物，檢測樣本中被13C或15N標記上的代謝物，就可以反應細胞的代謝過程。
BIOTREE建立了基于LC-MS/MS平臺的非靶標代謝流檢測分析方法，不局限于特定的代謝通路，可對臨床、動、植物樣本進行全面地研究代謝流量隨時間變化的動態(tài)規(guī)律，對流經(jīng)代謝途徑的代謝流量進行定量分析，能夠很好的解釋代謝物在代謝途徑中的變化，將代謝組學的研究提升到更高的水平和層次。
Wang, R., Yin, Y., Li, J. et al. Global stable-isotope tracing metabolomics reveals system-wide metabolic alternations in aging Drosophila. Nat Commun 13, 3518 (2022).
技術優(yōu)勢
? 準：對齊國際MSI 標準，level 1鑒定準確率高達98.5%
? 嚴：標準的數(shù)據(jù)庫建立流程；超嚴格6D質控體系
? 全：2w+ BiotreeDB 4.0標準品數(shù)據(jù)庫和專屬數(shù)據(jù)庫（臨床/植物/脂質專業(yè)自建數(shù)據(jù)庫）
? 多：高檢出，level 1平均檢出800+
? 廣：追蹤覆蓋范圍高，能夠對上千個代謝物同時進行穩(wěn)定同位素標記的追蹤
? 優(yōu)：儀器高靈敏、高分辨率，性能穩(wěn)定
樣本要求
液體 | 100 μL/sample |
組織 | 100 mg/sample |
類器官 | 100 mg/sample |
細胞 | 1×10? cells/sample |
檢測平臺
Orbitrap Exploris 120, Thermo
應用方向
? 非靶標代謝流分析可以廣泛應用于生命科學和醫(yī)藥研究中，包括細胞代謝調控、代謝新通路、疾病代謝機制、藥物新靶標發(fā)現(xiàn)與確證、藥物藥效及毒性評價、疾病診斷或預后生物標志物、藥物代謝組學、精準用藥等領域
? 基因工程：提高基因工程菌目標代謝產(chǎn)物；基因改造前后的代謝功能變化
? 疾病機理：揭示腫瘤代謝抑制劑個性化治療機制；疾病發(fā)生發(fā)展過程早期診斷的標志物
? 代謝重編程：炎癥性巨噬細胞免疫代謝重編程機制；植物葉綠體代謝重編程機制
案例應用
英文標題：Sarcosine sensitizes lung adenocarcinoma to chemotherapy by dual activation of ferroptosis via PDK4/PDHA1 signaling and NMDAR-mediated iron export
發(fā)表期刊：Experimental Hematology & Oncology
影響因子：13.5
研究背景：肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其中肺腺癌(Lung Adenocarcinoma, LUAD)是非小細胞肺癌中最常見的亞型，盡管治療手段不斷進步，其五年生存率仍不足26%，化療耐藥是導致預后不良的關鍵因素之一。鐵死亡作為一種鐵依賴的脂質過氧化程序性細胞死亡方式，因其能克服傳統(tǒng)治療耐藥性而成為研究熱點。越來越多證據(jù)表明，調控鐵死亡可增強腫瘤對化療的敏感性，但如何精準誘導鐵死亡并闡明其代謝調控機制仍不明確。肌氨酸作為內源性代謝物，在前列腺癌等腫瘤中與侵襲轉移相關，但其在LUAD中的作用未知。本研究通過代謝組學篩選發(fā)現(xiàn)肌氨酸顯著增強LUAD細胞對鐵死亡誘導劑(Ferroptosis Inducers, FINs)的敏感性。結合臨床數(shù)據(jù)與機制研究，證實肌氨酸通過雙重機制調控鐵死亡。此外，肌氨酸與順鉑聯(lián)用可協(xié)同增強化療敏感性，且臨床樣本中高肌氨酸水平與患者預后改善相關。本研究填補了肌氨酸在鐵死亡和LUAD中作用的空白，為克服化療耐藥提供了新靶點，其安全性和代謝調控特性使其有望成為鉑類化療的潛在佐劑，具有重要臨床轉化價值。
研究結果：
1、代謝物文庫篩選揭示肌氨酸增強LUAD細胞鐵死亡敏感性
為篩選調控鐵死亡的關鍵代謝物，并驗證肌氨酸是否通過特定機制增強LUAD細胞對鐵死亡的敏感性，研究首先對鐵死亡誘導劑RSL3處理的LUAD細胞系（A549和PC9）進行非靶代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)肌氨酸顯著下調等獨特代謝特征（圖1A-B）。隨后在RSL3誘導的鐵死亡模型中，利用包含889種人類內源性代謝物的文庫進行篩選，確定肌氨酸為RSL3介導鐵死亡的強效增強劑（圖1C-D）。
細胞毒性實驗顯示，肌氨酸與鐵死亡誘導劑（如RSL3、IKE）聯(lián)用可顯著降低細胞活力，且該協(xié)同效應可被鐵死亡抑制劑[脂質過氧化清除劑(Ferrostatin-1, Fer-1)、鐵螯合劑(Deferoxamine, DFO)]完全消除，但不受凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)或壞死性凋亡抑制劑(Necrosulfonamide)影響，確認肌氨酸促鐵死亡作用的特異性（圖1E–H）。進一步檢測顯示，外源性肌氨酸顯著增強RSL3誘導的脂質活性氧(Lipid-ROS)生成（圖1I）、胞內亞鐵離子積累（圖1J）和丙二醛(MDA)水平升高（圖1K）。透射電鏡觀察到肌氨酸處理后細胞線粒體嵴消失、體積縮小等鐵死亡特征性超微結構改變（圖1L）。
綜上，肌氨酸通過增強鐵依賴的脂質過氧化和線粒體功能紊亂，顯著提升LUAD細胞對鐵死亡的敏感性。
圖1. 代謝物文庫篩選揭示肌氨酸與鐵死亡相關
2、肌氨酸通過代謝重編程增強鐵死亡敏感性
為探究肌氨酸調控鐵死亡的機制，首先采用(15)N-肌氨酸同位素追蹤代謝流分析，發(fā)現(xiàn)肌氨酸在LUAD細胞中極少轉化為甘氨酸等下游代謝物（圖2A）。使用透析血清（去除小分子物質）培養(yǎng)細胞后，細胞內肌氨酸幾乎不可檢測，證實其主要來源于培養(yǎng)基血清，而非細胞從頭合成。這一結果排除了肌氨酸通過甘氨酸代謝（如谷胱甘肽合成）發(fā)揮作用的可能。
進一步通過非靶代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，肌氨酸處理后，丙酮酸水平顯著降低，檸檬酸水平顯著升高，差異代謝物顯著富集于三羧酸循環(huán)(TCA cycle)通路（圖2B-C）。Seahorse能量代謝檢測顯示，肌氨酸誘導細胞外酸化率(Extracellular Acidification Rate, ECAR)降低、耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)升高，證實代謝模式從糖酵解向氧化磷酸化轉變（圖2D）。活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)檢測顯示，肌氨酸處理組總 ROS 和線粒體 ROS 熒光強度顯著增加，提示線粒體電子傳遞鏈電子泄漏增加，導致超氧陰離子生成增多（圖2E-F）。此外，通過丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測發(fā)現(xiàn)，肌氨酸可顯著激活PDH，推動代謝通量進入TCA循環(huán)。
綜上，肌氨酸通過外源補充直接激活PDH，重塑代謝通路為氧化磷酸化模式，增強線粒體ROS爆發(fā)并打破氧化還原平衡，從而特異性提升LUAD細胞對鐵死亡的敏感性。該效應不依賴于肌氨酸的代謝轉化（如代謝為甘氨酸），而是通過調控代謝流實現(xiàn)。
圖2. 肌氨酸重塑細胞代謝以增強鐵死亡
3、肌氨酸通過抑制PDK4激活三羧酸循環(huán)
為探究肌氨酸誘導代謝轉向氧化磷酸化并增強鐵死亡敏感性的機制，研究發(fā)現(xiàn)肌氨酸可顯著激活丙酮酸脫氫酶(Pyruvate Dehydrogenase, PDH)活性（圖3A），并降低PDHA1（PDH復合物E1α亞基）S293 位點磷酸化水平（圖3B）。分子對接實驗顯示，肌氨酸與PDK4的BCDHK_Adom3結構域特異性結合（圖3C）。
通過CRISPR/Cas9技術構建PDK4敲除(PDK4-KO)細胞及BCDHK_Adom3結構域突變體（ΔAdom3，刪除 Asp118、Asp182、Ser183），發(fā)現(xiàn)PDK4缺失或BCDHK_Adom3結構域突變完全消除了肌氨酸對PDH活性的激活作用（圖3D）和PDHA1磷酸化的抑制效應（圖3E）。進一步檢測顯示，PDK4-KO細胞的線粒體ROS(Mito-ROS)水平在肌氨酸處理后顯著低于野生型細胞（圖3F-G），且對FINs(RSL3/IKE)的敏感性顯著增強（圖3H-I）。
綜上，肌氨酸通過直接結合PDK4的BCDHK_Adom3結構域，抑制其對PDHA1的磷酸化作用，從而激活PDH并推動代謝通量進入三羧酸循環(huán)。PDK4抑制是肌氨酸通過代謝重編程增強鐵死亡的核心分子機制。
圖3. 肌氨酸抑制PDK4，驅動TCA循環(huán)激活
4、肌氨酸激活NMDAR/MXD3信號通路以調控SLC40A1
為探究肌氨酸是否通過N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)信號通路調控鐵死亡及其分子機制，研究發(fā)現(xiàn)肌氨酸處理顯著下調亞鐵離子輸出跨膜蛋白SLC40A1的表達（圖4A）。DEPMAP數(shù)據(jù)顯示，LUAD細胞中SLC40A1表達與肌氨酸豐度呈負相關（圖4B）。功能實驗表明，肌氨酸可升高細胞內亞鐵離子水平（可被DFO逆轉），并負調控SLC40A1蛋白表達，而NMDAR拮抗劑MK-801則顯著逆轉這一效應（圖4C-E）。
轉錄組學分析進一步篩選出HLX、HSF4、MXD3和SCX為差異最顯著的轉錄因子（圖4F）。聚焦MXD3發(fā)現(xiàn)，其在LUAD中與SLC40A1表達呈負相關（圖4G）。構建MXD3敲低/過表達細胞系證實，MXD3缺失可顯著上調SLC40A1（圖4H-I），而免疫組化顯示，LUAD組織中MXD3與SLC40A1表達負相關，與脂質過氧化標志物4-HNE正相關（圖4J-K）。ChIP-qPCR證實MXD3直接結合于SLC40A1啟動子區(qū)域（圖4L），熒光素酶報告基因實驗進一步顯示，MXD3可抑制SLC40A1野生型啟動子活性（圖4M）。
綜上，肌氨酸通過激活NMDAR，誘導MXD3介導的SLC40A1轉錄抑制，減少鐵輸出并導致細胞內鐵蓄積，從而增強LUAD細胞對鐵死亡的敏感性。
圖4. 肌氨酸激活NMDAR/MXD3信號通路以調控SLC40A1
5、PDK4激活和NMDAR阻斷逆轉肌氨酸介導的鐵死亡
為研究PDK4和NMDAR對肌氨酸誘導鐵死亡的調節(jié)作用，通過構建過表達PDK4的LUAD細胞系（圖5A-B）并結合NMDAR藥理學抑制實驗，發(fā)現(xiàn)PDK4異位表達與NMDAR拮抗劑MK-801聯(lián)用(10 μM)，可顯著減弱肌氨酸的促鐵死亡效應。具體表現(xiàn)為：肌氨酸聯(lián)合RSL3/IKE誘導的脂質活性氧水平顯著降低（圖5D），且細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性降低（圖5C）。
綜上，PDK4激活與NMDAR阻斷可協(xié)同逆轉肌氨酸介導的鐵死亡，揭示兩者在肌氨酸調控鐵死亡通路中的關鍵作用（圖5C-D）。
圖5. PDK4激活和NMDAR阻斷逆轉肌氨酸介導的鐵死亡
6、肌氨酸通過鐵死亡增強CDDP敏感性
為探究肌氨酸是否通過鐵死亡途徑增強LUAD對順鉑(Cisplatin, CDDP)化療的敏感性，并驗證其臨床相關性，研究在LUAD細胞中添加外源性肌氨酸并聯(lián)合CDDP處理，發(fā)現(xiàn)肌氨酸可顯著提高細胞對CDDP的敏感性，且該效應能被鐵死亡抑制劑(Fer-1、DFO)削弱，證實其依賴鐵死亡途徑（圖6A-C）。單細胞測序分析顯示，NMDAR亞基編碼基因(GRIN1、GRIN2D)在腫瘤細胞中優(yōu)先表達，提示肌氨酸作用的腫瘤特異性（圖6D-G）。
臨床樣本分析顯示，在120例LUAD患者中，高肌氨酸水平組總生存期(OS)顯著優(yōu)于低肌氨酸水平組（圖6H）；在41例接受CDDP化療的亞組中，高肌氨酸水平患者OS呈改善趨勢（圖6I），且血清肌氨酸水平與OS呈正相關。綜上所述，這些數(shù)據(jù)強調了肌氨酸在增強順鉑療效和改善LUAD患者預后中的治療潛力。
圖6. 肌氨酸通過鐵死亡增強CDDP的敏感性
7、肌氨酸在患者來源PDOs和異種移植模型中增強治療效果
為在臨床前模型中驗證肌氨酸增強鐵死亡及化療敏感性的機制，研究通過慢病毒轉染構建PDK4過表達的LUAD類器官(Patient-Derived Organoids, PDOs)模型。形態(tài)學觀察顯示，肌氨酸處理導致PDOs萎縮，ATP酶活性檢測證實其代謝活性降低（圖7A-B），且對鐵死亡誘導劑(FINs)和順鉑(CDDP)的敏感性顯著提升（圖7C）。NMDAR拮抗劑MK-801處理可顯著消除肌氨酸的增敏作用（圖7D-E）。
在體內異種移植模型中，對照荷瘤小鼠(Ctrl)接受IKE(40 mg/kg)、CDDP(3 mg/kg)聯(lián)合肌氨酸（2 mM飲水）治療時，腫瘤生長顯著抑制（圖7G-I），而PDK4過表達腫瘤或MK-801處理組中肌氨酸的增強效應消失。多重免疫組織化學(mIHC)分析顯示，肌氨酸治療組腫瘤組織中脂質過氧化標志物4-HNE顯著升高，而PDK4過表達或MK-801處理可逆轉這一效應（圖7J）。
綜上，肌氨酸通過依賴PDK4抑制和NMDAR激活的雙重機制增強鐵死亡和化療敏感性，在克服LUAD治療耐藥性方面展現(xiàn)出顯著治療潛力。
圖7. 肌氨酸在患者來源類器官(PDOs)和異種移植模型中增強治療效果
非靶標代謝流綜合解決方案，數(shù)據(jù)分析軟件，質譜檢測技術及介紹，全面的聯(lián)用技術等。
